Automated gene sequencing
Automated gene sequencing

Le séquençage de l’ADN à grande échelle nécessite des procédures automatisées basées sur le marquage par fluorescence de l’ADN et des systèmes de détection appropriés. En général, un marqueur fluorescent peut être utilisé directement ou indirectement. Les marqueurs fluorescents directs, tels qu’utilisés dans le séquençage automatisé, sont des fluorophores. Ce sont des molécules qui émettent une couleur fluorescente distincte lorsqu’elles sont exposées à la lumière UV d’une longueur d’onde spécifique. Des exemples de fluorophores utilisés dans le séquençage sont la fluorescéine, qui émet une fluorescence verte pâle lorsqu’elle est exposée à une longueur d’onde de 494 nm; la rhodamine, qui émet une fluorescence rouge à 555 nm; et l’acide aminométhyl cumarin acétique, qui émet une fluorescence bleue à 399 nm. De plus, une combinaison de différents fluorophores peut être utilisée pour produire une quatrième couleur. Ainsi, chacune des quatre bases peut être marquée distinctement.

Une autre approche consiste à utiliser des produits amplifiés par PCR (séquençage thermique). Ceci présente l’avantage que l’on peut utiliser comme matériau de départ de l’ADN double brin plutôt que simple brin. Et puisque de petites quantités d’ADN matrice sont suffisantes, l’ADN à séquencer n’a pas besoin d’être cloné au préalable.

Séquençage du cycle thermique

L’ADN à séquencer est contenu dans l’ADN vecteur [1] Brown, T.A. Genomes. Bios Scientific Publ., Oxford, 1999. . L’amorce, un oligonucléotide court avec une séquence complémentaire du site de fixation sur l’ADN monocaténaire, est utilisée comme point de départ. Pour le séquençage de brins courts d’ADN, une amorce universelle est suffisante. Il s’agit d’un oligonucléotide qui se liera à l’ADN du vecteur adjacent à l’ADN à séquencer. Cependant, si ce dernier est plus long qu’environ 750 pb, seule une partie de celui-ci sera séquencée. Par conséquent, des amorces internes supplémentaires sont requises. Ceux-ci s’hybrident à des sites différents et amplifient l’ADN dans une série d’expériences contiguës de chevauchement de chaînes qui se chevauchent. [2] Rosenthal, N .: Structure fine d’un séquençage gène-ADN. Nouveau Eng. J. Med. 332: 589-591, 1995 . Ici, chaque amorce détermine quelle région de l’ADN matrice est en cours de séquençage. Dans le séquençage du cycle thermique [3] Strachan, T., Read, A.P .: Human Molecular Genetics. 2 e éd. Bios Scientific Publishers, Oxford, 1999. , une seule amorce est utilisée pour effectuer des réactions de PCR, chacune avec un didésoxynucléotide (ddA, ddT, ddG ou ddC) dans le mélange réactionnel. Cela génère une série de différents brins terminés par une chaîne, chacun dépendant de la position de la base nucléotidique particulière où la chaîne est terminée [4] Wilson, R.K., et al.: Développement d’une procédure automatisée pour le séquençage d’ADN fluorescent. Genomics 6: 626-636, 1990. . Après de nombreux cycles et avec l’électrophorèse, la séquence peut être lue comme indiqué dans la plaque précédente. Un avantage du séquençage du cycle thermique est que l’ADN double brin peut être utilisé comme matière de départ.

Séquençage automatisé de l’ADN (principe)

Le séquençage automatisé de l’ADN implique quatre fluorophores, un pour chacune des quatre bases nucléotidiques. Le signal fluorescent résultant est enregistré à un point fixe lorsque l’ADN traverse un capillaire contenant un gel électrophorétique. Les marqueurs fluorescents spécifiques de la base sont attachés aux didésoxynucléotides triphosphates appropriés (ddNTP). Chaque ddNTP est marqué avec une couleur différente, par exemple, vert ddATP, bleu ddCTP, jaune ddGTP et ddTTP rouge [5] Brown, T.A. Genomes. Bios Scientific Publ., Oxford, 1999. . (Les couleurs réelles pour chaque nucléotide peuvent être différentes.) Toutes les chaînes terminées à l’adénine (A) donneront un signal vert; toutes les chaînes terminées à une cytosine (C) donneront un signal bleu, et ainsi de suite. Les réactions de séquençage basées sur ce type de terminaison de la chaîne à nucléotides marqués <n Rosenthal, N .: Structure fine d’un séquençage d’ADN-gène. Nouveau Eng. J. Med. 332: 589-591, 1995 </fn> sont réalisées automatiquement dans des capillaires de séquençage [6] Strachan, T., Read, A.P .: Human Molecular Genetics. 2 e éd. Bios Scientific Publishers, Oxford, 1999. . La migration électrophorétique des chaînes marquées ddNTP dans le gel dans le capillaire passe devant un faisceau laser focalisé sur une position fixe. Le laser induit un signal fluorescent qui dépend du marqueur spécifique représentant l’un des quatre nucléotides. La séquence est lue électroniquement et enregistrée et est visualisée sous forme de pics alternés dans l’une des quatre couleurs, représentant les nucléotides alternés dans leurs positions de séquence. En pratique, les pics ne montrent pas nécessairement la même intensité maximale que dans le diagramme schématique montré ici. (Illustration basée sur celle de Brown, 1999, et Strachan et Read, 1999).

Automated DNA sequencing
Automated DNA sequencing

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Références   [ + ]

1, 5. Brown, T.A. Genomes. Bios Scientific Publ., Oxford, 1999.
2. Rosenthal, N .: Structure fine d’un séquençage gène-ADN. Nouveau Eng. J. Med. 332: 589-591, 1995
3, 6. Strachan, T., Read, A.P .: Human Molecular Genetics. 2 e éd. Bios Scientific Publishers, Oxford, 1999.
4. Wilson, R.K., et al.: Développement d’une procédure automatisée pour le séquençage d’ADN fluorescent. Genomics 6: 626-636, 1990.

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