L’ADN recombinant et les enzymes de restriction

L’ADN recombinant et les enzymes de restriction

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L’ADN recombinant et les Anticorps monoclonaux
L’ADN recombinant et les Anticorps monoclonaux

La technologie de l’ADN recombinant est un moyen extrêmement important dans la biotechnologie, cette technologie permet de construire n’importe quelle protéine en l’occurrence des anticorps, tout simplement par changement de la carte génétique. Deux enzymes naturelles clés sont utilisées sont ADN ligase et les enzymes de restriction qui permettent de moduler l’information génétique dans un seul brin d’ADN. Avant cette découverte, on avait recourt à des produits chimiques ou de rayonnements ionisants qui réagissent de façon aléatoire, actuellement, on peut agir sur le code génétique précisément et à l’échelle atomique.

Les enzymes de restriction

Une enzyme de restriction est une protéine qui est capable  d’inciser un fragment de DNA au niveau d’une séquence nucléotidique spécifique appelée site de restriction. Chaque enzyme de restriction reconnaît ainsi un site spécifique

Les enzymes de restriction sont immensément utiles, certains poissons hébergent un grand nombre de bactéries pour lutter contre les infections virales. Les bactéries fabriquent des enzymes de restriction qui coupent l’ADN viral à un ordre spécifique, modifient bases en même temps, pour les protéger de l’action de la même enzyme.

Beaucoup d’enzymes de restriction coupent les deux brins d’ADN à la fois, au lieu de couper un seul. La biotechnologie intervient dans ce cas, les terminaisons du gène sont terminées par des extrémités adhésives à d’autres extrémités similaires, donc les enzymes de restriction peuvent être utilisées pour couper et créer de nouvelles régions adhésives au niveau des séquences cibles, qui sont ensuite collées ensemble selon les besoins.

Aujourd’hui, la technologie de l’ADN recombinant a développé, de nouvelles méthodes, nombreuses, ont été découvertes pour moduler les fonctions des bionanomachines cellulaires de façon continue. On peut extraire les gènes cibles à partir d’une cellule, en reproduire une quantité importante de copies, provoquer des mutations, recombinaisons, épissage, afin de créer entièrement  de nouveaux gènes. En fin on peut remplacer des gènes cellulaires par ces gènes pour modifier son information génétique.

Figure. La technologie d’ADN recombinant est basée sur deux enzymes: E de restriction (EcoRI à gauche) et les ligases.
Figure. La technologie d’ADN recombinant est basée sur deux enzymes: E de restriction (EcoRI à gauche) et les ligases.

Disponibilité des enzymes de restriction

plus de 100 enzymes de restriction sont disponibles, chacune coupe l’ADN à un ordre spécifique de base, une ligase, une DNA polymérase.

Il existe des méthodes automatisées qui permettent la synthèse des brins d’ADN de 100 nucléotides de longueur. Une fois qu’une copie soit réalisée, elle passerait à la phase de reproduction: par clonage et réaction en chaîne de la polymérase, on emploie souvent ainsi les cellules bactériennes en raison de leur multiplication rapide, cette méthode consiste à incorporer la séquence voulue dans un bactériophage qui infecte la bactérie, la séquence génétique est insérée et on attend le résultat après de nombreuses divisions. Les plasmides à côté du matériel génétique bactrien, sont les plus employés. La PCR peut être employée aussi, elle tire profit de la polymérase pour produire plusieurs copies de la séquence génétique.

une fois que la séquence est réalisée, on a recourt à des vecteurs d’expression, les plasmides qui contiennent le gène codant pour une protéine possèdent une séquence dite promoteur ayant une grande spécificité. Le promoteur qui est souvent pris d’un virus, provoque la création de grandes quantités d’ARN messager, la cellule synthétiserait en l’occurrence, plusieurs protéines correspondantes. Les bactéries sont plus idéales à ces opérations, car peuvent créer un nombre plus important de ces protéines, et comprendre une quantité importante entre 1-10% de la totalité des protéines cellulaires. Il existe même des techniques de fermentation, peu coûteuses, permettant une croissance massive des bactéries avec des besoins nutritionnels minimes.

Les bactéries posent en fait quelques problèmes, elles ne disposent pas de matériel de maturation, cependant, de nombreuses cellules végétales possèdent à leurs surfaces des groupes d’hydrate de carbone, qui sont incorporées aux protéines à la fin de leur synthèse, les bactéries n’en possèdent pas (limitation sévère dans l’industrie pharmaceutique). Le système immunitaire peut dans certains cas réagir dangereusement avec les hydrates de carbone, attachées aux protéines cellulaires (système ABO).

En outre, les protéines ont tendance, dans certains moment, de former des agrégats spécifiques avec un arrangement soigneusement calculé, facilement mis  en évidence par microscopie. Le manque de certains groupements peut être à l’origine d’un réarrangement aléatoire, et la formation des corps durs, la solubilisation de ces corps se trouvera difficile.

Il est tout à fait possible de renaturer les protéines des inclusions dures, ils sont les plus lourdes, alors une centrifugation des composants cellulaires peut aider à les extraire.

Les protéines peuvent être également construites sans avoir recourt à des cellules vivantes, cela est fait dans des éprouvettes spéciales. L’ARN qui se trouve dans les cytoplasmes cellulaires, et un excellent appui technique, en effet, l’extraction des composés cytoplasmiques contenant des bionanomachines de synthèse protéique, mais avec peut de chances de réussir à accomplir parfaitement la tâche, car le stock énergétique limité et la présence des protéases et de nucléase mettent rapidement fin à cette aventure. Des systèmes continus sans cellule, ont surmonté ce problème. Des tentatives de recréer des protéines avec des préparations purifiées ont réussi, mais avec un rendement modeste dû à la complexité de ces systèmes. En gros le développent des systèmes de production de protéines non dépendant de l’activité cellulaire sont l’objet des recherches.

Carte de restriction : exemple du plasmide pBR322

Le plasmide pBR322 est l’un des vecteurs les plus employés sur l’E. coli. Il contient 4361 paires de bases d’ADN, et comprend des régions qui codent à diverses fonctions, ampR, telR. En provoquant des coupures dans des régions spécifiques par les enzymes de restriction, on pourrait coller de nouveaux gènes, par exemple si le nouveau fragment d’ADN est ajouté à la région Pstl, à la position 3607, il provoquerait des perturbations au niveau du gène de –ampR, la bactérie peut être facilement identifiée et séparée (sensible à la tétracycline).

 

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