Southern blot

Les endonucléases de restriction sont des enzymes clivant l’ADN avec des séquences définies comme cibles. Ils sont souvent simplement appelés enzymes de restriction. Puisque chaque enzyme clive l’ADN uniquement à sa séquence de reconnaissance spécifique, l’ADN total d’un individu présent dans les cellules nucléées peut être découpé en morceaux de taille gérable et définie d’une manière reproductible. Des fragments d’ADN individuels peuvent ensuite être sélectionnés, ligaturés dans des vecteurs appropriés, multipliés et examinés. En raison de la distribution inégale des sites de reconnaissance, les fragments d’ADN diffèrent en taille. Un mélange de départ de fragments d’ADN est trié en fonction de la taille. Deux procédures détectent les fragments cibles d’ADN ou d’ARN après leur taille par électrophorèse sur gel – l’hybridation par transfert de Southern pour l’ADN (nommé d’après E. Southern qui a développé cette méthode en 1975) et l’hybridation Northern blot pour l’ARN (un jeu de mots sur Southern , pas nommé d’après un Dr Northern). Immunoblotting (Western blot) détecte les protéines par une procédure basée sur les anticorps.

Hybridation par Southern Blot

L’analyse commence avec l’ADN total (1). L’ADN est isolé et coupé avec des enzymes de restriction (2). L’un des fragments non encore identifiés contient le gène recherché ou une partie du gène. Les fragments sont triés par taille dans un gel (généralement de l’agarose) dans un champ électrique (électrophorèse) (3). Plus le fragment est petit, plus vite il migre; plus il est grand, plus il migre lentement. Ensuite, le transfert est effectué: les fragments contenus dans le gel sont transférés sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon (4). Là, l’ADN est dénaturé (rendu simple brin) avec de l’alcali et fixé à la membrane par chauffage modéré (~ 80 ° C) ou réticulation UV. L’échantillon est incubé avec une sonde d’ADN monocaténaire complémentaire (ADN génomique ou ADNc) du gène (5). La sonde s’hybride uniquement avec le fragment complémentaire recherché, et non avec d’autres (6). Puisque la sonde est marquée avec du 32P radioactif, le fragment recherché peut être identifié en plaçant un film radiographique sur la membrane, où il apparaît sous la forme d’une bande noire sur le film après développement (autoradiogramme) (6). La taille, correspondant à la position, est déterminée en faisant passer des fragments d’ADN de taille connue dans l’électrophorèse.

Southern blot hybridization

Hybridation par Southern Blot

Polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP)

Dans environ 100 paires de bases d’un segment d’ADN, la séquence nucléotidique diffère chez certains individus (polymorphisme de l’ADN). En conséquence, la séquence de reconnaissance d’une enzyme de restriction peut être présente sur un chromosome mais pas sur l’autre. Dans ce cas, les tailles des fragments de restriction diffèrent sur ce site (polymorphisme de longueur des fragments de restriction, RFLP). Un exemple est montré pour deux segments d’ADN de 5 kb (5000 paires de bases). Dans l’un, un site de restriction au milieu est présent (allele1); dans l’autre (allele2) il est absent. Avec un transfert de Southern, on peut déterminer si à cet endroit un individu est homozygote 1-1 (deux allèles 1, pas de fragment de 5 kb), hétérozygote 1-2 (un allèle chacun, 1 et 2), ou homozygote 2-2 (deux allèles 2). Si la mutation recherchée repose sur le chromosome portant le fragment de 5 kb, la présence de ce fragment indique la présence de la mutation. L’absence de ce fragment indiquerait que la mutation est absente. Il est important de comprendre que le RFLP lui-même n’est pas lié à la mutation. Il distingue simplement les fragments d’ADN de différentes tailles de la même région. Ceux-ci peuvent être utilisés comme marqueurs pour distinguer les allèles dans une analyse de ségrégation. En plus des RFLP, d’autres types de polymorphisme de l’ADN peuvent être détectés par hybridation par transfert de Southern, bien que l’analyse des microsatellites à base de réaction en chaîne de la polymérase soit maintenant utilisée plus fréquemment.

Restriction fragment length polymorphism (RFLP)
Polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP)
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