Aujourd’hui nous avons plusieurs méthodes pour travailler à l’échelle atomique, les chimistes construisent  atome par atome les molécules. Richard Feynman lors sa présentation de son exposé, a insisté que la chimie est un moyen puissant pour la conception moléculaire. Les physiciens utilisent des microscopes atomiques pour piéger les atomes et les molécules avec des pinces optiques, les bionanotechnologues seront armés d’une collection de biomachinerie naturelle afin d’exécuter des tâches spécifique à l’échelle du nano.

La bionanotechnologie est le domaine le plus performant que tout autre domaine en nanotechnologie. Les outils nécessaires pour concevoir des bionanomachines peuvent être disponibles partout avec un ordinateur et un plan, la porte est ouverte contrairement à la nanotechnologie basée sur le silicium qui coute chère en matière de matériel et de matériau.

La modification des biomachines naturelles a ouvert la porte devant plusieurs préoccupations, en effet, en provoquant des changements spécifiques sur des protéines naturelles, en liant entre des plans d’un ensemble de protéines, créant des molécules hybrides  à fonctions combinées. En utilisant ces propriétés, on peut machiner des bactéries pour produire une quantité considérable de mutants ou de chimères.

La conception des biomachines nouvelles est effectivement plus difficile que leur modification, la flexibilité par exemple, est difficile à prévoir et concevoir. L’un des objets essentiels des études actuelles en bionanotechnologie et de tenter à fabriquer une néo-bionanomachine à partir de zéro. Une synthase de nanotubes peut être conçue à l’aide d’un ordinateur qui calcule intégralement les mouvements et les rotations, mais difficilement, car les connaissances actuelles comprennent toujours des lacunes.

Aujourd’hui, nous pouvons prévoir sûrement la structure pliée d’une protéine à partir de l’ordre de sa structure chimique, mais ne pourrions pas prévoir son activité chimique.

Dans ce chapitre on va présenter une vue d’ensemble des nombreuses techniques qui sont employées aujourd’hui pour la conception, la synthèse, l’analyse des biomolécules.

La technologie de l’ADN recombinant

[1] La technologie de l’ADN recombinant est le moyen capital, cette technologie permet de construire n’importe quelle protéine, tout simplement par changement de la carte génétique. Deux enzymes naturelles clés sont utilisées sont ADN ligase et les enzymes de restriction qui permettent de moduler l’information génétique dans un seul brin d’ADN. Avant cette découverte, on avait recourt à des produits chimiques ou de rayonnements ionisants qui réagissent de façon aléatoire, actuellement, on peut agir sur le code génétique précisément et à l’échelle atomique.

[2] Les enzymes de restriction sont immensément utiles, certains poissons hébergent un grand nombre de bactéries pour lutter contre les infections virales. ?: les bactéries fabriquent des enzymes de restriction qui coupent l’ADN viral à un ordre spécifique, modifient bases en même temps, pour les protéger de l’action de la même enzyme.

[3] Beaucoup d’enzymes de restriction coupent les deux brins d’ADN à la fois, au lieu de couper un seul. La biotechnologie intervient dans ce cas, les terminaisons du gène sont terminées par des extrémités adhésives à d’autres extrémités similaires, donc les enzymes de restriction peuvent être utilisées pour couper et créer de nouvelles régions adhésives au niveau des séquences cibles, qui sont ensuite collées ensemble selon les besoins.

[4] Aujourd’hui, la technologie de l’ADN recombinant a développé, de nouvelles méthodes, nombreuses, ont été découvertes pour moduler les fonctions des bionanomachines cellulaires de façon continue. On peut extraire les gènes cibles à partir d’une cellule, en reproduire une quantité importante de copies, provoquer des mutations, recombinaisons, épissage, afin de créer entièrement  de nouveaux gènes. En fin on peut remplacer des gènes cellulaires par ces gènes pour modifier son information génétique.

Figure. La technologie d’ADN recombinant est basée sur deux enzymes: E de restriction (EcoRI à gauche) et les ligases.

L’ADN peut être monté par des enzymes disponibles en commerce

[5] plus de 100 enzymes de restriction sont disponibles, chacune coupe l’ADN à un ordre spécifique de base, une ligase, une DNA polymérase,

[6] il existe des méthodes automatisées qui permettent la synthèse des brins d’ADN de 100 nucléotides de longueur. Une fois qu’une copie soit réalisée, elle passerait à la phase de reproduction: par clonage et réaction en chaîne de la polymérase, on emploie souvent ainsi les cellules bactériennes en raison de leur multiplication rapide, cette méthode consiste à incorporer la séquence voulue dans un bactériophage qui infecte la bactérie, la séquence génétique est insérée et on attend le résultat après de nombreuses divisions. Les plasmides à côté du matériel génétique bactrien, sont les plus employés. La PCR peut être employée aussi, elle tire profit de la polymérase pour produire plusieurs copies de la séquence génétique.

[7] une fois que la séquence est réalisée, on a recourt à des vecteurs d’expression, les plasmides qui contiennent le gène codant pour une protéine possèdent une séquence dite promoteur ayant une grande spécificité. Le promoteur qui est souvent pris d’un virus, provoque la création de grandes quantités d’ARN messager, la cellule synthétiserait en l’occurrence, plusieurs protéines correspondantes. Les bactéries sont plus idéales à ces opérations, car peuvent créer un nombre plus important de ces protéines, et comprendre une quantité importante entre 1-10% de la totalité des protéines cellulaires. Il existe même des techniques de fermentation, peu coûteuses, permettant une croissance massive des bactéries avec des besoins nutritionnels minimes

[8] Les bactéries posent en fait quelques problèmes, elles ne disposent pas de matériel de maturation, cependant, de nombreuses cellules végétales possèdent à leurs surfaces des groupes d’hydrate de carbone, qui sont incorporées aux protéines à la fin de leur synthèse, les bactéries n’en possèdent pas (limitation sévère dans l’industrie pharmaceutique). Le système immunitaire peut dans certains cas réagir dangereusement avec les hydrates de carbone, attachées aux protéines cellulaires (système ABO).

En outre, les protéines ont tendance, dans certains moment, de former des agrégats spécifiques avec un arrangement soigneusement calculé, facilement mis  en évidence par microscopie. Le manque de certains groupements peut être à l’origine d’un réarrangement aléatoire, et la formation des corps durs, la solubilisation de ces corps se trouvera difficile.

Il est tout à fait possible de renaturer les protéines des inclusions dures, ils sont les plus lourdes, alors une centrifugation des composants cellulaires peut aider à les extraire,

[9] Les protéines peuvent être également construites sans avoir recourt à des cellules vivantes, cela est fait dans des éprouvettes spéciales. L’ARN qui se trouve dans les cytoplasmes cellulaires, et un excellent appui technique, en effet, l’extraction des composés cytoplasmiques contenant des bionanomachines de synthèse protéique, mais avec peut de chances de réussir à accomplir parfaitement la tâche, car le stock énergétique limité et la présence des protéases et de nucléase mettent rapidement fin à cette aventure. Des systèmes continus sans cellule, ont surmonté ce problème. Des tentatives de recréer des protéines avec des préparations purifiées ont réussi, mais avec un rendement modeste dû à la complexité de ces systèmes. En gros le développent des systèmes de production de protéines non dépendant de l’activité cellulaire sont l’objet des recherches.

Figure. Le plasmide pBR322 est l’un des vecteurs les plus employés pour machiner E. coli. Il contient 4361 paires de bases d’ADN, et comprend des régions qui codent à diverses fonctions, ampR, telR. En provoquant des coupures dans des régions spécifiques par les enzymes de restriction, on pourrait coller de nouveaux gènes, par exemple si le nouveau fragment d’ADN est ajouté à la région Pstl, à la position 3607, il provoquerait des perturbations au niveau du gène de –ampR, la bactérie peut être facilement identifiée et séparée (sensibles à la tétracycline).

Figure. L’Action de la polymérase dans la PCR

  1. La mutagénèse dirigée provoque des changements spécifiques au niveau du génome:

[10] Dans plusieurs cas, on devrait faire de petits changements sur la protéine naturelle. La mutagénèse dirigée sert à modifier la séquence des acides aminés, par cette méthode, nous pouvons provoquer des changements à l’échelle atomique sur la structure protéique, changement de la structure et la fonction, certaines mutations provoquées sont d’une spécificité superbe.

[11] la mutation dirigée vers un emplacement spécifique a révolutionné la biologie moléculaire. C’est un outil puissant pour déterminer la fonction des acides aminés spécifiques ou des régions dans une protéine. Par exemple en provoquant des mutations sur un groupe d’acides aminé un par un afin de savoir lequel est responsable d’une telle activité.de cette façon l’emplacement actif d’une enzyme sur un récepteur d’hormone peut être localisé. Elle peut être aussi employée dans le cadre d’amélioration de la stabilité protéique en les ajustant selon un ordre bien déterminé.

Les protéines de fusion combinent 2 fonctions

[12] Des techniques d’ADN recombinant sont également employées pour combiner des gènes entiers, formant une protéine plus grande multifonctionnelle. Cette opération doit être faite avec soin par sélection précise des emplacements de coupure, de sorte que les protéines fusionnées ne bloquent pas les unes les autres lorsqu’elles se plient, heureusement, beaucoup de protéines naturelles sont très robustes et remplissent leurs fonctions même à l’état fusionné.

Figure. Les mutagénèses dirigées

[13] Les protéines de fusion visent plusieurs cibles à la fois, elles portent un peptide signal employé comme poigné pour identifier l’endroit approprié, ce peptide est attaché à la protéine par les techniques d’ADN recombinant.

[14] Dans la version naturelle du lysozyme, dans les extrémités opposées deux acides aminés, quand la protéine se plie, ils s’approchent en haut et ferment la structure, dans la version modifiée, les deux acides aminés sont remplacés par la cystéine. Quand la protéine se plie les deux cystéines établissent un pont disulfure (en rouge) et stabilisent la structure pliée.

Les anticorps monoclonaux

[15] Le système immunitaire des anomaux est conçu pour bien remplir la fonction de connaître spécifiquement les structures moléculaires étrangères, de point de vue biotechnologique, les structures de base sont les anticorps, notre système immunitaire est capable de générer 1015 types d’anticorps, en combinant ce paquet moléculaire avec les connaissances modernes de production d’anticorps, on pourra optimiser l’affinité de ces anticorps aux molécules cibles.

Figure. Les immunotoxines sont créées par combinaison d’une protéine toxique avec un anticorps, elles sont testées pour le traitement du cancer.

Figure. Les anticorps typiques sont constitués de deux bras d’accepteurs spécifiques, reliés par une liaison flexible au domaine central, un fragment Fc qui leur permet de se lier aux cellules/organites coopératrices de l’organisme. (Lysozyme en rose)

[16] en raison de leur forte liaison aux molécules cibles, les anticorps purifiés constituent un bon moyen pour identifier une cible donnée, (HIV), localisation des protéines dans l’organisme,

[17] des anticorps monoclonaux peuvent être fabriqués à partir d’une série de cellules tumorales identiques de façon chronique.

La détermination de la structure biomoléculaire

[18] Comme noté par Richard Feymann, la clé de la compréhension de la biologie est la possibilité de voir ce que les cellules font. Vers les années 50, John Kendrew et ces collègues ont résolu la structure de la myoglobine, en indiquant en détails, les arrangements des divers groupements atomiques. Depuis lors, des milliers de structures moléculaires, de protéines, lipides, acides nucléiques, polysaccharides, ont pu être comprises. Une banque de protéines a été mise à la disposition publique: http://www.pdb.org.

La détermination des structures des biomolécules, bien que sensiblement rationnelle,  reste toujours le sujet de plusieurs efforts parfois coûteux. On va sonner certaines méthodes utilisées dans la détermination des structures des biomolécules. Car  connaître  la structure moléculaire réelle d’une molécule est le point de départ en bionanotechnologie.

La cristallographie avec les rayons X fournit les structures atomiques

[19] La cristallographie avec les rayons X fournit actuellement la plus part des informations détaillées sur la structure atomique, ça coute en matières de ressources considérablement cher, et nécessite un labo spécialisé avec une bonne manœuvre.

[20] L’information expérimentale obtenue à partir d’une analyse cristallographique est une carte 3D représentant la densité des électrons. La résolution de cette carte dépend de l’emplacement des points auxquels la densité des électrons est résolue, et de la charge, la qualité des cristaux. Les meilleurs cristaux des biomolécules sont parfaitement résolus. Les structures séparées de moins d’un angström sont facilement résolues. Les études cristallographiques des protéines sont relativement pauvres,  dans la bande de 1,5 – 3 angströms; à la résolution de 1,5 Å différents atomes peuvent être facilement distingués. Mais pour 3 Å, la connaissance de la structure covalente sera indispensable pour interpréter les morceaux mal interprétés.

[21]  Les facteurs thermiques (valeurs B) des positions atomiques à l’intérieur du model est de très bonne indication dans la détermination du niveau, auquel, les positions peuvent être acceptées. Ça constitue en outre une méthode pour la modulation du désordre de chaque position atomique. Des Atomes modèles sont souvent traités comme une distribution Gaussiennes autour du centre atomique, les valeurs B qui contrôlent la largeur de la courbe en cloche. Une dizaine de valeurs B représente les atomes avec des positions très claires, tendis, une trentaine représente les atomes en désordre, ce qui doit être pris en précaution.

[22] La structure obtenue par cristallographie donne une représentation instantanée des conformations moléculaires.

Figure. Les structures d’une protéine donnée peuvent montrer des différences une fois analysées à l’intérieur de divers cristaux. Deux structures du lysozyme sont superposées (noir et rose)

  1. La spectroscopie NMR peut être utilisée pour conclure les structures atomiques:

[23] La spectroscopie à résonance magnétique nucléaire (NMR) est la base de la détermination de la structure moléculaire en chimie. Cette méthode dépend de l’environnement local des noyaux atomiques qui possèdent chacun un moment magnétique intrinsèque lui alignant dans un fort champ magnétique. Cet alignement peut être perturbé par des pulsations à fréquences radio de longueurs d’ondes appropriées, quand les noyaux relâchent de leur alignement, ils émettent des rayonnements qui dépendent des fréquences des ondes  reçues ce qui reflète l’environnement local de l’atome.

[24] La spectroscopie NMR est intensivement employée en chimie afin de définir les liaisons covalentes ainsi que les conformations des petites molécules organiques, les NMR 2D permettent l’étude des structures des petites protéines; la radiofréquence à pulsations multiples permet de perturber plusieurs noyau à la fois, qui émettent simultanément plusieurs rayonnements, mais si un noyau absorbe en premier le rayonnement, il va modifier la valeur d’émission du noyau à coté, ce décalage permet d’établir une liste des noyaux qui sont à proximité.

Des protéines de petite et de moyenne taille allant de 100-250 aminoacides ont pu être mises en évidence par cette méthode de point de vue structurel.

Figure. Les données de la spectroscopie RMN sont souvent interprétées pour tirer un ensemble de structures possibles. Dans ce schéma une dizaine de structures différentes de lysozyme superposées, notant que la chaîne protéique principale est presque la même dans chaque cas.

[25] plus souvent les structures fournies par RMN diffèrent et la seule interprétation qui peut soulever les contraintes est l’existence de plusieurs conformations surtout à l’état libre.

Le microscope électronique révèle la structure moléculaire

[26] La microscopie électronique peut résoudre la structure subatomique, avec une résolution maximale de 2 nm, ceci est suffisant pour déterminer plusieurs détails structuraux.

[27] La microscopie électronique peut montrer la structure globale d’une biomolécule (exemple l’actine et le moteur de  myosine), l’ordinateur peut aider, à une grande part, de reconstituer l’image en recombinant beaucoup de morceaux perdus.

[28] La microscopie électronique fournit des informations précieuses, dont aucune des méthodes précédentes ne peut les révéler, ex: les molécules qui subissent des changements structuraux permanents.

La microscopie électronique combinée avec les informations données par la cristallographie à rayons X, spectroscopie, RMN, et la modélisation moléculaire, peut donner la structure atomique de grandes assemblées moléculaires. Par exemple: la structure du ribosome, beaucoup de grands virus, l’interaction de l’actine avec la myosine. Ceux sont bien des molécules importantes qu’on a tiré profit de cette combinaison de méthodes pour mieux les connaître.

Les microscopes électroniques de transmission et de balayage sont employés pour la détermination des structures des bionanomachines. Le microscope à transmission est similaire au microscope photonique, en effet, un faisceau d’électrons qui ‘illumine’ un échantillon mince, le contraste des images obtenues est faible, il faudrait ajouter les sels des métaux lourds tels que l’uranium, osmium, malheureusement, ce procédé de coloration présente des obstacles pendant le traitement et le  séchage, la microscopie cryo-électronique soulève ces limites mais diminue la force du contraste. L’échantillon est gelé dans la glace, le contraste entre la molécule et la glace est faible. En établissant une moyenne de plusieurs images afin de minimiser le bruit dû au contraste faible. Dans les meilleurs cas la tomographie électronique peut fournir des images 3D de la molécule, ces images sont rassemblées et sont inclinées chacune d’un angle spécifique qui sert à reconstituer la molécule en 3D.

[29] La microscopie électronique à balayage donne une image 3D,  les électrons sont dispersés sur la surface de l’échantillon qui est préparé par fixation et lavage et entouré d’une couche mince de métal, il est ensuite balayé par un faisceau étroit d’électrons pour visualiser l’image de la surface. En raison de l’indispensabilité de la couche métallique, la résolution ne peut pas dépasser les 10 nm (arrangement de l’actine et la myosine des les sarcomères à l’intérieur du muscle)

La microscopie à force atomique examine les surfaces des biomolécules

[30] Cette méthode est la plus performante, elle établit une liaison plus directe entre le monde macroscopique et le monde atomique. Pour balayer la surface l’échantillon est déplacé par trame, il est monté et abaissé afin d’appliquer une force constante sur l’extrémité. Le balayage latéral et les  changements de la hauteur de l’échantillon sont contrôlés par des piezoscanners, les forces sur l’encorbellement sont détectées par l’éclat d’un rayon laser sur le dos de celui-ci. L’échantillon peut être balayé en mode continu ce qui permet une mesure précise de la hauteur. Le tapement du balayage résout les problèmes des forces de cisaillement en oscillant le bout. La résolution de l’image est dépendante de l’acuité du bout (5-10 nm).

[31] L’analyse des échantillons en microscopie à force atomique est faite dans l’eau, les échantillons secs maintiennent une couche mince d’eau sur leurs surfaces, les forces capillaires diminuent, masquent les force de répulsion, attraction exercées sur le bout définissant la forme.

[32] La microscopie à force atomique a prouvé un grand succès dans le domaine biotechnologique, sa sensibilité pour mesurer des forces le long de la trajectoire de l’attraction ou de la répulsion entre les atomes l’a rendu très utile dans la compréhension du dynamisme du repliement des protéines et d’autres bionanomachines. (arrangement des atomes d’Ar pour créer des corrals quantiques avec des caractéristiques particulières).

Figure. Chez  IBM, la microscopie à force atomique a été utilisée pour réarranger les atomes de Fer en corrals, ce qui permet d’étudier les propriétés mécanique quantiques inconnues de cet arrangement. (Figure from http://www.almaden.ibm.com/vis/stm/corral.html)

La modélisation moléculaire

[31] Dans la conception des nouvelles biomachines, l’informatique travail main à main avec l’expérimentation.les calculs permettent ainsi des explorations des systèmes qui sont expérimentalement inaccessibles

[32] Les bionanomachines sont visualisées par des logiciels informatiques; RASMOL, PROTEIN EXPLORER, CHIME, (http://www.rcsb.org/pdb/software-list.html).

Figure. Représentation graphique du lysozyme avec le programme RasMol, à gauche en ruban, excellent outil pour comprendre la topologie et les pliements.

[33] La modélisation informatique des biomolécules peut prédire la structure et la fonction: optimisation, analyse en mode normal, dynamique moléculaire, perturbation d’énergie libre. Ceci est suffisant dans le cadre structurel et catalytique, mais il ne permet pas de s’étendre à long échelle en temps réel (repliement des protéines: complexe)

[34] Le problème de repliement des protéines: il pose des difficultés graves dues aux 2 raison: l’incapacité de définir un plan exact de conformations adoptées surtout pour les régions flexibles des protéines liées et composées d’une 1OOaine d’aminoacides. La méthode employée pour estimer la stabilité de chaque conformation, les protéines pliées renferment plusieurs contacts internes (milliers) (l’entrée et la sortie de l’eau)

L’entropie (S) joue de sa part un rôle important contre les énergies favorables de contact.

[35] Les algorithmes employés aujourd’hui pour la définition des structures protéiques sont basés sur l’ordre de la séquence et calibrés par utilisation des structures connues de plusieurs protéines.

  1. Les simulations d’expansion prévoient le mode d’interaction des biomolécules:

[36] Des programmes informatiques peuvent être utilisés pour calculer les interactions possibles entres les biomolécules, particulièrement les protéines, malheureusement, il n’est pas tout à fait possible de les utiliser en cas de grosses molécules. La majorité de ces programmes fonctionne comme suit: un algorithme qui se lance et calcule rapidement toutes les positions possibles des molécules dans l’environnement, en second lieu, un modèle énergétique aidera à déterminer les meilleures positions. Les méthodes populaires: AutoDock, Dock

Figure. Les médicaments peuvent être de même conçus par des programmes informatiques à Docking automatique, afin de prévoir  le meilleur emplacement au niveau du site cible. (Exemple: médicament qui réagit contre la protéase virale (HIV))

Nouvelles fonctionnalités ont été développées avec les ordinateurs assistés par des programmes de conception

[37] Plusieurs succès récents en bionanotechnologie impliquant l’introduction d’une nouvelle fonctionnalité dans une biomolécule naturelle. Le moteur de ces conceptions est l’informatisation de l’environnement moléculaire, cette méthode permet au chercheur de concevoir une nouvelle structure, la réduire en minimum; cette approche combinée avec la dynamique moléculaire a incité une excitation précieuse dans le monde de la nanotechnologie moléculaire. Elle a été intensivement utilisée pour créer des scénarios de mutations dirigées. Elle exige en fait, la créativité et l’expérience.

Quelques méthodes par exemple, commencent par combinaison de milliers de fragments de 5-10 atomes au niveau du site actif, les meilleurs sont choisis pour former petit à petit la biomolécule entière. Autres commencent par une molécule de base ou « brute » en ajoutant des groupements spécifiques jusqu’à ce que le site soit parfaitement rempli, cela donne d’excellents résultats.

 

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